Skip to main content

Wyposażenie i metody badawcze ZLRF

Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności Polskiej Akademii Nauk w Olsztynie > Zespół Lokalnych Regulacji Fizjologicznych > Wyposażenie i metody badawcze ZLRF

Metody badawcze

1. Metody in vivo

  • pomiar prędkości przepływu krwi w tętnicy macicznej świni z zastosowaniem elektromagnetycznego transducera (elektromagnetic flowmeter RT500 Narcomatic) w znieczuleniu ogólnym
  • pomiar ciśnienia wewnątrzmacicznego/pośrednio aktywności skurczowej macicy świni (Bridge Amp AD Instruments) w znieczuleniu ogólnym
  • metody biotechniki rozrodu u owiec: synchronizacja owulacji owiec (gąbki dopochwowe) i przyspieszanie sezonu rozrodczego (implanty melatoniny) do celów doświadczalnych
  • laparotomia pośrodkowa świń i owiec: owariektomia, histerektomia, wywoływanie ischemii macicy przez zamknięcie tętnicy macicznej świni, przyżyciowe pobieranie skrawków macicy, implantowanie kaniul do naczyń krwionośnych krezki macicy świni w celu wielogodzinnego pobierania krwi i/lub infuzji substancji biologicznie aktywnych (np. hormonów) w znieczuleniu ogólnym
  • implantowanie kaniul do naczyń krwionośnych głowy i szyi u świni, owcy, królika w znieczuleniu ogólnym
  • długotrwałe (12-godzinne) pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego z III komory mózgu u owiec
  • długotrwałe pobieranie krwi z żyły szyjnej zewnętrznej u świń i owiec
  • ciągłe monitorowanie saturacji krwi tlenem oraz nasycenie wydychanego powietrza dwutlenkiem węgla przy zastosowaniu pulsoksymetru z detektorem CO2 (Nonin Medical Inc.9847V) w znieczuleniu ogólnym

2. Metody ex vivo

  • badania aktywności skurczowej żył powierzchownych głowy świni (żyły czołowa, nosowa, twarzowa)
  • badania aktywności skurczowej izolowanych tętnic układu rozrodczego samicy świni (tętnica maciczna)
  • badania na izolowanej głowie świni, owcy, królika perfundowanej autologiczną krwią
  • badania na izolowanym jajniku, macicy (świni), jadrze (świnia, szczur) perfundowanych autologiczną krwią

3. Inkubacje tkankowe

  • skrawki podwzgórza świni

4. Metody analitycze

4.1 Metody biologii molekularnej

Ekspresja na poziomie mRNA metodą Real Time PCR (qPCR) lub Real Time PCR z zastosowaniem sondy (qPCR TaqMan) oraz białka metodą western-blot (WB):

  • czynniki związane z produkcją płynu mózgowo-rdzeniowego: VEGF, jego receptory Flt-1, Flk-1 i koreceptor NRP-1, akwaporyna-1,  akwaporyna-4, klaudyna-2 (qPCR, WB) w splocie naczyniówkowym komór mózgu u owiec
  • białka połączeń zamykających limitujących przechodzenie substancji na drodze międzykomórkowej: białka błonowe okludyna, klaudyna-1 i JAM-1 oraz białka cytozolowe ZO-1, ZO-2, ZO-3 i afadyna-6 (qPCR, WB) w splocie naczyniówkowym komór mózgu u owiec
  • białka transporterowe: transtyretyna (TTR) w splocie naczyniówkowym komór mózgu u owiec (qPCR)
  • kompleks receptora lipopolisacharydu (LPS): receptor toll-podobny 4 (TLR4), CD14 i  MD-2 (qPCR) w splocie naczyniówkowym komór mózgu u owiec
  • cytokiny i ich receptory oraz chemokiny: TNFα, IL-1β, IL-6, TNFRI, TNFRII, IL-1R1, IL-1R2, IL-6R, gp130, MCP-1 (qPCR) w splocie naczyniówkowym komór mózgu u owiec
  • metaloproteinazy i ich inhibitory: MMP2, MMP3, MMP9, TIMP-1 i TIMP-3 (qPCR) w splocie naczyniówkowym komór u owiec
  • marker hipoksji HIF-1α w macicy świni (qPCR, WB)
  • białka zegara biologicznego w podwzgórzu świni domowej: BMAL 1, CLOCK, NPAS2, PER 1-3, CRY 1-2 (qPCR TaqMan, WB)
  • receptory jądrowe powiązane z funkcjonowaniem molekularnego zegara biologicznego w podwzgórzu świni domowej: REV-ERB α, REV-ERB β, ROR α, ROR β, ROR γ – (qPCR TaqMan)
  • enzymy antyoksydacyjne w jądrach i najądrzach samca sarny oraz żubra: EcSOD, GpX 4 i GpX 5 (qPCR), SOD-1, Cat (qPCR, WB) oraz SOD-1, SOD-2 w macicy świni (qPCR)
  • receptor leptyny (Ob-Ra i Ob-Rb) w splocie naczyniówkowych komór mózgu oraz w podwzgórzu świni domowej (qPCR, WB)

4.2 Immunoenzymatyczne oznaczanie stężeń w osoczu (ELISA):

  • LPS Binding Protein u owiec
  • IL-6 u owiec

4.3 Immunoizotopowe oznaczanie stężeń (RIA) w osoczu, tkankach, płynach ustrojowych:

  • hormonów tarczycy: T3 i T4 (wolne i całkowite)
  • melatonina
  • hormonów związanych z funkcjonowaniem układu rozrodczego: estradiol, estron, progesteron, testosteron, oksytocyna, prostaglandyna F2α świni
  • hormonów białkowych: prolaktyna (PRL), luteotropina (LH), folikulotropina (FSH), aktywina A i leptyna świni

4.4.Radioizotopowe znakowanie hormonów

  • Jodowanie (J125) oksytocyny, GnRH, FSH, LH, prolaktyny, β-endorfiny

4.5 Immunohistochemiczna lokalizacja (z zastosowaniem fluorochromów):

  • białka c-Fos, produktu genu wczesnej odpowiedzi komórkowej, w strukturach mózgu świni
  • NADPH-diaforazy (metodą histochemiczną) w naczyniach krwionośnych mózgu świni
  • syntaz tlenku azotu iNOS, eNOS w macicy oraz okołojajnikowym kompleksie naczyniowym świni, w jelicie grubym szczura
  • endogennego markera hipoksji HIF-1α w macicy i jajowodach świni
  • enzymów antyoksydacyjnych SOD-1, SOD-2 w narządach układu rozrodczego samicy świni, jelicie grubym myszy
  • czynnika wzrostu śródbłonka naczyń VEGF oraz jego receptorów Flt-1, Flk-1 w splocie naczyniówkowym komór mózgu owcy białka antyapoptotycznego cFLIP w narządach układu rozrodczego samicy świni
  • komórek apoptotycznych metodą TUNEL (Terminal Transferase dUTP Nick End Labeling) w macicy świni, jelicie grubym szczura
  • enzymu hydroksylazy dopaminowej (DβH) w naczyniach krwionośnych głowy (żyła twarzowa, nosowa, czołowa) oraz okołojajnikowego kompleksu naczyniowego świni
  •  receptora leptyny w splocie naczyniówkowym mózgu oraz w podwzgórzu świni
  • receptora TLR4 (toll-like receptor) oraz CD14 w splocie naczyniówkowym komór mózgu owcy

4.6 Analiza gęstości optycznej wyrażonej w jednostkach densytometrycznych

  • pomiary intensywności reakcji barwnej obserwowanej w mikroskopie z zastosowaniem programu Axio Vision Rel. 4.8.2

Wykaz aparatury

1. Urządzenia stosowane w doświadczeniach in vivo, ex vivo:

  • Aparat do narkozy wziewnej dla dużych zwierząt (KOMESAROFF MINI-KOM)
  • Kardiomonitor (TEMED)
  • Pulsoksymetr z detektorem CO2 (Nonin Medical Inc. 9847V)
  • Zestaw do badań na izolowanych narządach (UNIPER, UP-100; Hugo Sachs Elektronik-Harvard)
  • Zestaw do badań na izolowanych naczyniach i mięśniówce gładkiej (HSE F30, type 372; Hugo Sachs Elektronik)
  • Pompy infuzyjne
  • Pompy perystaltyczne (Elphan, ZALIMP)
  • Urządzenie do pomiaru przepływu krwi z transducerami (Narcomatic)
  • Wiertarka chirurgiczna (Eskulap)

2.    Sprzęt laboratoryjny stosowany w analizie western blot:

  • Aparat do elektroforezy białek-pionowa (BIO-RAD PowerPac, Invitrogen)
  • Aparat do mokrego transferu (BIO-RAD PowerPac)
  • Mieszadło hematologiczne (Chemland)

3.    Sprzęt laboratoryjny stosowany w analizie kwasów nukleinowych:

  • Komora z przepływem laminarnym (Polon)
  • Aparat do elektroforezy kwasów nukleinowych-horyzontalna (BIO-RAD PowerPac)

4.    Sprzęt laboratoryjny stosowany w analizach RIA:

  • Licznik do pomiaru promieniowania gamma (LKB)
  • Licznik do pomiaru promieniowania beta (Beckman)
  • Radiometr Rust-3 z sondą

5.    Podstawowy sprzęt laboratoryjny:

  • Aparat próżniowy BioVac 225 (OmegaLab)
  • Spektrofotometr (Beckman)
  • Mikroskop stereoskopowy
  • Mikroskop MBL 180T
  • Termoblok (OmegaLab)
  • Worteksy (Biosan)
  • Wytrząsarki (Biosan)
  • Wytrząsarka z komorą inkubacyjną (Edmund Bűhler)
  • Mieszadła magnetyczne (Biosan, IKA WERKE)
  • Łaźnia wodna z przykrywką (Pracowania elektroniki i aparatury elektronicznej)
  • pH-metr stacjonarny (HANNA instruments)
  • Wirówki (Biosan, StarLab)
  • Wirówka z chłodzeniem (Beckam,MPW Med. Instruments)
  • Wagi elektroniczna (RADWAG, MEDICAT LTD)
  • Ultrazamrażarka (SANYO)
  • Wyciąg chemiczny (Polon)
  • Wytwornica lodu (Scotsman)
  • Aparat Hamilton Microlab 1000