Oddział Biologii Rozrodu

ZAKŁAD MECHANIZMÓW DZIAŁANIA HORMONÓW

kontakt: dr hab. Agnieszka Blitek prof. nadzw.
tel. +48 89 539 31 12, e-mail: a.blitek@pan.olsztyn.pl

1. Przygotowanie materiału do badań:
   • Izolacja komórek: ciałka żółtego, myometrium, endometrium, nabłonka jajowodu,
   • Hodowle komórek i skrawków: inkubator (BB 6060, Heraeus, Niemcy);
2. Metody analityczne i pomiarowe:

• Ocena przeżywalności komórek (test cytotoksyczności): czytnik ELISA (Multiscan EX, Labsystems, Finlandia)
• Enzymoimmunologiczne oznaczanie hormonów steroidowych, białkowych i prostaglandyn (czytnik ELISA, Multiscan EX,Labsystems)
• Klasyczna technika PCR i jej modyfikacje: RT-PCR, nested-PCR, touchdown PCR (system dokumentacji żeli MiniBIS Pro)
• Pomiar zmian ekspresji genów metodą RT PCR i Real-time PCR:
• izolacja RNA, (spektrofotometr BioPhotometr, Eppendorf, oraz spektrofotometr Nonodrop)
  • odwrotna transkrypcja, PCR (termocykler MJ Mini BioRad)
  • system detekcji dla Real-time PCR (APB Prism 7300 Applied Biosystems, USA)
  • system do analizy obrazu MiniBIS Pro (DNR Bio Imaging System, Israel)
• 5’ i 3’ RACE PCR – szybka amplifikacja końców cDNA
• Pomiar ilości białka metodą Western Blot: Mini PROTEAN 3 System (system dokumentacji żeli MiniBIS Pro).
• Pomiar mobilizacji wewnątrzkomórkowych jonów Ca2+ z wykorzystaniem barwnika fluorescencyjnego Fura 2 (mikroskop Nikon Eclipse TS 100 z oprogramowaniem do analizy NIS-Elements Basic Research),
• Immunohistochemia (kriostat, analiza obrazu – mikroskop Imager Z1-Zeiss z oprogramowaniem Axio Vision 4.8).
• Pomiar aktywności motorycznej (kurczliwości) skrawków myometrium i jajowodu: tensometr (Hugo Sachs Elektronik, Niemcy – urządzenie na stanie ZLRF)
• Oznaczanie katecholamin metodą HPLC z detekcją elektrochemiczną (Hewlett-Packard, Series 1050)

ZAKŁAD LOKALNYCH REGULACJI FIZJOLOGICZNYCH

kontakt: dr hab. n.wet. Barbara Wąsowska prof. nadzw.
tel. +48 89 539 31 25, e-mail: b.wasowska@pan.olsztyn.pl1. Metody in vivo

• pomiar prędkości przepływu krwi w tętnicy macicznej świni z zastosowaniem elektromagnetycznego transducera (elektromagnetic flowmeter RT500 Narcomatic) w znieczuleniu ogólnym
• pomiar ciśnienia wewnątrzmacicznego/pośrednio aktywności skurczowej macicy świni (Bridge Amp AD Instruments) w znieczuleniu ogólnym
• metody biotechniki rozrodu u owiec: synchronizacja owulacji owiec (gąbki dopochwowe) i przyspieszanie sezonu rozrodczego (implanty melatoniny) do celów doświadczalnych
• laparotomia pośrodkowa świń i owiec: owariektomia, histerektomia, wywoływanie ischemii macicy przez zamknięcie tętnicy macicznej świni, przyżyciowe pobieranie skrawków macicy, implantowanie kaniul do naczyń krwionośnych krezki macicy świni w celu wielogodzinnego pobierania krwi i/lub infuzji substancji biologicznie aktywnych (np. hormonów) w znieczuleniu ogólnym
• implantowanie kaniul do naczyń krwionośnych głowy i szyi u świni, owcy, królika w znieczuleniu ogólnym
• długotrwałe (12-godzinne) pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego z III komory mózgu u owiec
• długotrwałe pobieranie krwi z żyły szyjnej zewnętrznej u świń i owiec
• ciągłe monitorowanie saturacji krwi tlenem oraz nasycenie wydychanego powietrza dwutlenkiem węgla przy zastosowaniu pulsoksymetru z detektorem CO2 (Nonin Medical Inc.9847V) w znieczuleniu ogólnym

2. Metody ex vivo

• badania aktywności skurczowej żył powierzchownych głowy świni (żyły czołowa, nosowa, twarzowa)
• badania aktywności skurczowej izolowanych tętnic układu rozrodczego samicy świni (tętnica maciczna)
• badania na izolowanej głowie świni, owcy, królika perfundowanej autologiczną krwią
• badania na izolowanym jajniku, macicy (świni), jadrze (świnia, szczur) perfundowanych autologiczną krwią

3. Inkubacje tkankowe

• skrawki podwzgórza świni

4. Metody analitycze

4.1 Metody biologii molekularnej

Ekspresja na poziomie mRNA metodą Real Time PCR (qPCR) lub Real Time PCR z zastosowaniem sondy (qPCR TaqMan) oraz białka metodą western-blot (WB):

• czynniki związane z produkcją płynu mózgowo-rdzeniowego: VEGF, jego receptory Flt-1, Flk-1 i koreceptor NRP-1, akwaporyna-1,  akwaporyna-4, klaudyna-2 (qPCR, WB) w splocie naczyniówkowym komór mózgu u owiec
• białka połączeń zamykających limitujących przechodzenie substancji na drodze międzykomórkowej: białka błonowe okludyna, klaudyna-1 i JAM-1 oraz białka cytozolowe ZO-1, ZO-2, ZO-3 i afadyna-6 (qPCR, WB) w splocie naczyniówkowym komór mózgu u owiec
• białka transporterowe: transtyretyna (TTR) w splocie naczyniówkowym komór mózgu u owiec (qPCR)
• kompleks receptora lipopolisacharydu (LPS): receptor toll-podobny 4 (TLR4), CD14 i  MD-2 (qPCR) w splocie naczyniówkowym komór mózgu u owiec
• cytokiny i ich receptory oraz chemokiny: TNFα, IL-1β, IL-6, TNFRI, TNFRII, IL-1R1, IL-1R2, IL-6R, gp130, MCP-1 (qPCR) w splocie naczyniówkowym komór mózgu u owiec
• metaloproteinazy i ich inhibitory: MMP2, MMP3, MMP9, TIMP-1 i TIMP-3 (qPCR) w splocie naczyniówkowym komór u owiec
• marker hipoksji HIF-1α w macicy świni (qPCR, WB)
• białka zegara biologicznego w podwzgórzu świni domowej: BMAL 1, CLOCK, NPAS2, PER 1-3, CRY 1-2 (qPCR TaqMan, WB)
• receptory jądrowe powiązane z funkcjonowaniem molekularnego zegara biologicznego w podwzgórzu świni domowej: REV-ERB α, REV-ERB β, ROR α, ROR β, ROR γ – (qPCR TaqMan)
• enzymy antyoksydacyjne w jądrach i najądrzach samca sarny oraz żubra: EcSOD, GpX 4 i GpX 5 (qPCR), SOD-1, Cat (qPCR, WB) oraz SOD-1, SOD-2 w macicy świni (qPCR)
• receptor leptyny (Ob-Ra i Ob-Rb) w splocie naczyniówkowych komór mózgu oraz w podwzgórzu świni domowej (qPCR, WB)

4.2 Immunoenzymatyczne oznaczanie stężeń w osoczu (ELISA):

• LPS Binding Protein u owiec
• IL-6 u owiec

4.3 Immunoizotopowe oznaczanie stężeń (RIA) w osoczu, tkankach, płynach ustrojowych:

• hormonów tarczycy: T3 i T4 (wolne i całkowite)
• melatonina
• hormonów związanych z funkcjonowaniem układu rozrodczego: estradiol, estron, progesteron, testosteron, oksytocyna, prostaglandyna F2α świni
• hormonów białkowych: prolaktyna (PRL), luteotropina (LH), folikulotropina (FSH), aktywina A i leptyna świni

4.4.Radioizotopowe znakowanie hormonów

• Jodowanie (J125) oksytocyny, GnRH, FSH, LH, prolaktyny, β-endorfiny

4.5 Immunohistochemiczna lokalizacja (z zastosowaniem fluorochromów):

• białka c-Fos, produktu genu wczesnej odpowiedzi komórkowej, w strukturach mózgu świni
• NADPH-diaforazy (metodą histochemiczną) w naczyniach krwionośnych mózgu świni
• syntaz tlenku azotu iNOS, eNOS w macicy oraz okołojajnikowym kompleksie naczyniowym świni, w jelicie grubym szczura
• endogennego markera hipoksji HIF-1α w macicy i jajowodach świni
• enzymów antyoksydacyjnych SOD-1, SOD-2 w narządach układu rozrodczego samicy świni, jelicie grubym myszy
• czynnika wzrostu śródbłonka naczyń VEGF oraz jego receptorów Flt-1, Flk-1 w splocie naczyniówkowym komór mózgu owcy białka antyapoptotycznego cFLIP w narządach układu rozrodczego samicy świni
• komórek apoptotycznych metodą TUNEL (Terminal Transferase dUTP Nick End Labeling) w macicy świni, jelicie grubym szczura
• enzymu hydroksylazy dopaminowej (DβH) w naczyniach krwionośnych głowy (żyła twarzowa, nosowa, czołowa) oraz okołojajnikowego kompleksu naczyniowego świni
•  receptora leptyny w splocie naczyniówkowym mózgu oraz w podwzgórzu świni
• receptora TLR4 (toll-like receptor) oraz CD14 w splocie naczyniówkowym komór mózgu owcy

4.6 Analiza gęstości optycznej wyrażonej w jednostkach densytometrycznych

• pomiary intensywności reakcji barwnej obserwowanej w mikroskopie z zastosowaniem programu Axio Vision Rel. 4.8.2

1. Wyznaczenie pI oraz masy cząsteczkowej analizowanych białek nasienia kręgowców. Mapowanie białek (protein mapping) plazmy nasienia ryb i ptaków. Analiza profili białkowych.
2. Izolacja białek i peptydów nasienia kręgowców, określenie podstawowych właściwości fizykochemicznych białek.
3. Izolacja białek i peptydów, rozdział peptydów powstałych w wyniku trawienia białek, przygotowanie preparatów do sekwencjonowania i spektroskopii mas.
4. Pomiar koncentracji plemników, oznaczenie podstawowych biochemicznych wyznaczników jakości nasienia, pomiar aktywności antyoksydacyjnej nasienia, analizy kinetyczne (określenie stężenia enzymów i inhibitorów, wyznaczenie stałych asocjacji dla oddziaływania inhibitor – proteinaza, wyznaczenie widm białek w zakresie UV i światła widzialnego.
5. Elektroelucja białek z żelu.
6. Pomiar koncentracji i przeżywalności plemników.
7. Ocena stanu genomu plemników.
8. Wizualizacja profili białkowych plazmy nasienia.
9. Transfer białek na membranę, analiza Western blot
10. Pomiar ciśnienia osmotycznego plazmy nasienia
11. Obserwacja i analiza fluorescencyjna komórek somatycznych i gamet
12. Rozdziały białek i kwasów rybonukleinowych na żelach poliakrylamidowych i agarozowych.
13. Transfer białek na membranę, analiza Western Blot

ZAKŁAD BIOLOGII I PATOLOGII ROZRODU CZŁOWIEKA

kontakt: dr Jan Czerniecki
tel. +48 85 746 88 18, e-mail: j.czerniecki@pan.olsztyn.pl

1. Izolacja DNA i RNA (automatyczna stacja do izolacji kwasów nukleinowych 6100 Nucleic Acid PrepStatus, Applied Biosystems);
2. Analiza ekspresji genów metodą Real-Time PCR (7500 Real-Time PCR System, Applied Biosystems);
3. Analiza polimorfizmów genowych metodą sekwencjonowania DNA (3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems);
4. Analiza ekpresji białek metodą Western-Blot (elektroforeza i elektrotransfer białek oraz immunodetekcja zestaw do elektroforezy poliakrylamidowej białek i mokrego elektrotransferu, Amersham, zestaw do dokumentacji żeli-Uvitec);
5. Hodowle komórkowe:
   • komora laminarna IVFtech Sterile,
   • inkubator IKS International NB-203XL,
   • mikroskop laboratoryjny w układzie odwróconym OlympusCKX41,
   • zamrażarka niskotemperaturowa Snijders,
   • pierwotne oraz linie komórkowe: m.in. rak janika linia CRL-11731, rak piersi linia MCF7 i MDA-MB-231, fibroblasty linia CRL 1474.

LABORATORIUM BIOLOGII MOLEKULARNEJ

kontakt: dr Monika Kaczmarek
tel. +48 89 539 31 12, e-mail: a.kaczmarek@pan.olsztyn.pl

kontakt: prof. dr hab. Jan Glogowski

tel. +48 89 539 31 34, e-mail: j.glogowski@pan.olsztyn.pl

Posiadane obecnie zaplecze laboratoryjne, sprzętowe oraz technologiczne pozwala nam na prowadzenie i rozwijanie na odpowiednio wysokim poziomie  centrum pozyskiwania, oceny, konserwowania oraz przechowywania w ciekłym azocie  rezerw genetycznych wielu gatunków zwierząt. Posiadany system komputerowej analizy nasienia (CASA) umożliwi badanie wpływu różnych czynników, w tym występujących w środowisku toksykantów,  na morfologię i parametry ruchu plemników oraz ocenę ich jakości po kriokonserwacji.

kontakt: doc. dr hab. Barbara Jana

tel. +48 89 539 31 40, e-mail: b.jana@pan.olsztyn.pl

1. Immunoenzymatyczne (ELISA) i immunoizotopowe (RIA) oznaczanie stężeń hormonów:

   • hormonów białkowych (LH, PRL) i receptorów LH/hCG z użyciem preparatów znakowanych jodem (J-125)
   • wykonywanie jodowań hormonów białkowych (LH, PRL) i cytokin (IL-1β, IL-6, TNF-α),
   • hormonów steroidowych (P4, A4, T, E1, E2, kortyzol),
   • prostaglandyn (PGE2, PGF2α) oraz metabolitu PGF2α – PGFM
   • oksytocyny i endoteliny przy zastosowaniu hormonów znakowanych peroksydazą chrzanową (HRP) lub biotyną.
2. Analiza parametrów krytycznych i gazometrii krwi:
   Analiza parametrów gazometrii, elektrolitów i oksymetrii przy zastosowaniu analizatora parametrów krytycznych RAPIDpoint 405 (SIEMENS):
   • gazometria: pH, pCO2, pO2,
   • elektrolity: NA+, K+, Ca++, Cl-,
   • glukoza, HCT,
   • oksymetria: sO2, FO2Hb, FCOHb, FHHb, FMetHb, THb,

   wraz z wieloma wyliczanymi parametrami pochodnymi.

3. Morfometryczna analiza krwi:

   • dwutorowy pomiar leukocytów w dwóch niezależnych kanałach
   • podstawowe i rozszerzone badania morfologiczne krwi bydła, kozy, owcy, konia, świni, kota, psa, królika, świnki morskiej, szczura oraz myszy, przy zastosowaniu analizatora hematologicznego ADVIA 2120i (SIEMENS).

   Wymagana objętość próbki krwi do badań wynosi 157 µl.

4. Immunochemiczno–chemiluminescencyjna analiza krwi przy zastosowaniu analizatora immunochemicznego IMMULITE®1000 (SIEMENS):
   • analiza stężeń hormonów nadnerczy/przysadki, płciowych (np. P4, T, E2, kortyzol),
   • analizy z zakresu fizjologii tarczycy,
   • analizy stężeń czynników wzrostu,
   • analiza markerów stanu zapalnego (IL-1β, TNF-α, IL-10, LBP),
   • analiza wskaźników alergii, anemii, cukrzycy,
   • analiza markerów kardiologicznych, chorób zakaźnych, nowotworowych,
   • stężeń leków

   Materiałem do analiz jest surowica, osocze, medium hodowlane.

5. Analiza specyficznych immunoglobulin E przy zastosowaniu aparatu ImmunoCAP 100:
   • Phadiatop – test przesiewowy różnicujący pacjentów atopowych od nieatopowych,
   • całkowita IgE,
   • całkowita IgE (niski poziom) – dla małych dzieci,
   • specyficzne IgE  – ponad 500 alergenów pojedynczych oraz 70 mieszanek,
   • białko eozynofilowe ECP – monitorowanie leczenia astmy,
   • tryptaza – monitorowanie stanu anafilaksji,
   • gliadyny IgA i IgG – nietolerancja pokarmowa u dzieci,
   • specyficzne IgA w odniesieniu do poszczególnych frakcji mleka,
   • specyficzne IgG oraz IgG4,
   • przeciwciała przeciwtarczycowe: anty-TPO, anty-TG,
   • ponad 22 parametry z zakresu chorób autoimmunologicznych w klasie IgG, IgA,

   W celu wykonania analizy niezbędne jest 40 µl surowicy pacjenta.

6. Jakościowe oznaczania in vitro ludzkich przeciwciał klasy IgG oraz IgE z zastosowaniem aparatu Euroimmun:
   • Metoda immunoblottingu do oceny swoistych przeciwciał klasy IgE skierowanych przeciwko alergenom w surowicy pacjenta,
   • Dostępne panele zawierające kombinacje alergenów po 20 różnych na jednym pasku testowym (wziewny, pediatryczny wziewny, pokarmowy, atopowy), dwa dla jadów owadów, oraz „Profil pediatryczny” zawierający 27 najpopularniejszych alergenów m.in.: spośród alergenów pokarmowych białko i żółtko jaja, białka mleka, mąka pszenna, ryż, soja, owoce i warzywa, a spośród wziewnych: pyłki traw i drzew, alergeny roztoczy i sierści zwierząt.

   Do wykonania analizy niezbędne jest 100 µl surowicy pacjenta.

7. Wykrywanie białek czynnościowych (cytokiny, białka efektorowe, receptory, markery powierzchniowe lub przeciwciała) wydzielanych przez pojedyncze komórki przy zastosowaniu zestawu ELISpot (Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay).

Adres poczty elektronicznej jest chroniony przed robotami spamującymi. W przeglądarce musi być włączona obsługa JavaScript, żeby go zobaczyć.