Metody badawcze
1. Metody in vivo
- pomiar prędkości przepływu krwi w tętnicy macicznej świni z zastosowaniem elektromagnetycznego transducera (elektromagnetic flowmeter RT500 Narcomatic) w znieczuleniu ogólnym
- pomiar ciśnienia wewnątrzmacicznego/pośrednio aktywności skurczowej macicy świni (Bridge Amp AD Instruments) w znieczuleniu ogólnym
- metody biotechniki rozrodu u owiec: synchronizacja owulacji owiec (gąbki dopochwowe) i przyspieszanie sezonu rozrodczego (implanty melatoniny) do celów doświadczalnych
- laparotomia pośrodkowa świń i owiec: owariektomia, histerektomia, wywoływanie ischemii macicy przez zamknięcie tętnicy macicznej świni, przyżyciowe pobieranie skrawków macicy, implantowanie kaniul do naczyń krwionośnych krezki macicy świni w celu wielogodzinnego pobierania krwi i/lub infuzji substancji biologicznie aktywnych (np. hormonów) w znieczuleniu ogólnym
- implantowanie kaniul do naczyń krwionośnych głowy i szyi u świni, owcy, królika w znieczuleniu ogólnym
- długotrwałe (12-godzinne) pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego z III komory mózgu u owiec
- długotrwałe pobieranie krwi z żyły szyjnej zewnętrznej u świń i owiec
- ciągłe monitorowanie saturacji krwi tlenem oraz nasycenie wydychanego powietrza dwutlenkiem węgla przy zastosowaniu pulsoksymetru z detektorem CO2 (Nonin Medical Inc.9847V) w znieczuleniu ogólnym
2. Metody ex vivo
- badania aktywności skurczowej żył powierzchownych głowy świni (żyły czołowa, nosowa, twarzowa)
- badania aktywności skurczowej izolowanych tętnic układu rozrodczego samicy świni (tętnica maciczna)
- badania na izolowanej głowie świni, owcy, królika perfundowanej autologiczną krwią
- badania na izolowanym jajniku, macicy (świni), jadrze (świnia, szczur) perfundowanych autologiczną krwią
3. Inkubacje tkankowe
- skrawki podwzgórza świni
4. Metody analitycze
4.1 Metody biologii molekularnej
Ekspresja na poziomie mRNA metodą Real Time PCR (qPCR) lub Real Time PCR z zastosowaniem sondy (qPCR TaqMan) oraz białka metodą western-blot (WB):
- czynniki związane z produkcją płynu mózgowo-rdzeniowego: VEGF, jego receptory Flt-1, Flk-1 i koreceptor NRP-1, akwaporyna-1, akwaporyna-4, klaudyna-2 (qPCR, WB) w splocie naczyniówkowym komór mózgu u owiec
- białka połączeń zamykających limitujących przechodzenie substancji na drodze międzykomórkowej: białka błonowe okludyna, klaudyna-1 i JAM-1 oraz białka cytozolowe ZO-1, ZO-2, ZO-3 i afadyna-6 (qPCR, WB) w splocie naczyniówkowym komór mózgu u owiec
- białka transporterowe: transtyretyna (TTR) w splocie naczyniówkowym komór mózgu u owiec (qPCR)
- kompleks receptora lipopolisacharydu (LPS): receptor toll-podobny 4 (TLR4), CD14 i MD-2 (qPCR) w splocie naczyniówkowym komór mózgu u owiec
- cytokiny i ich receptory oraz chemokiny: TNFα, IL-1β, IL-6, TNFRI, TNFRII, IL-1R1, IL-1R2, IL-6R, gp130, MCP-1 (qPCR) w splocie naczyniówkowym komór mózgu u owiec
- metaloproteinazy i ich inhibitory: MMP2, MMP3, MMP9, TIMP-1 i TIMP-3 (qPCR) w splocie naczyniówkowym komór u owiec
- marker hipoksji HIF-1α w macicy świni (qPCR, WB)
- białka zegara biologicznego w podwzgórzu świni domowej: BMAL 1, CLOCK, NPAS2, PER 1-3, CRY 1-2 (qPCR TaqMan, WB)
- receptory jądrowe powiązane z funkcjonowaniem molekularnego zegara biologicznego w podwzgórzu świni domowej: REV-ERB α, REV-ERB β, ROR α, ROR β, ROR γ – (qPCR TaqMan)
- enzymy antyoksydacyjne w jądrach i najądrzach samca sarny oraz żubra: EcSOD, GpX 4 i GpX 5 (qPCR), SOD-1, Cat (qPCR, WB) oraz SOD-1, SOD-2 w macicy świni (qPCR)
- receptor leptyny (Ob-Ra i Ob-Rb) w splocie naczyniówkowych komór mózgu oraz w podwzgórzu świni domowej (qPCR, WB)
4.2 Immunoenzymatyczne oznaczanie stężeń w osoczu (ELISA):
- LPS Binding Protein u owiec
- IL-6 u owiec
4.3 Immunoizotopowe oznaczanie stężeń (RIA) w osoczu, tkankach, płynach ustrojowych:
- hormonów tarczycy: T3 i T4 (wolne i całkowite)
- melatonina
- hormonów związanych z funkcjonowaniem układu rozrodczego: estradiol, estron, progesteron, testosteron, oksytocyna, prostaglandyna F2α świni
- hormonów białkowych: prolaktyna (PRL), luteotropina (LH), folikulotropina (FSH), aktywina A i leptyna świni
4.4.Radioizotopowe znakowanie hormonów
- Jodowanie (J125) oksytocyny, GnRH, FSH, LH, prolaktyny, β-endorfiny
4.5 Immunohistochemiczna lokalizacja (z zastosowaniem fluorochromów):
- białka c-Fos, produktu genu wczesnej odpowiedzi komórkowej, w strukturach mózgu świni
- NADPH-diaforazy (metodą histochemiczną) w naczyniach krwionośnych mózgu świni
- syntaz tlenku azotu iNOS, eNOS w macicy oraz okołojajnikowym kompleksie naczyniowym świni, w jelicie grubym szczura
- endogennego markera hipoksji HIF-1α w macicy i jajowodach świni
- enzymów antyoksydacyjnych SOD-1, SOD-2 w narządach układu rozrodczego samicy świni, jelicie grubym myszy
- czynnika wzrostu śródbłonka naczyń VEGF oraz jego receptorów Flt-1, Flk-1 w splocie naczyniówkowym komór mózgu owcy białka antyapoptotycznego cFLIP w narządach układu rozrodczego samicy świni
- komórek apoptotycznych metodą TUNEL (Terminal Transferase dUTP Nick End Labeling) w macicy świni, jelicie grubym szczura
- enzymu hydroksylazy dopaminowej (DβH) w naczyniach krwionośnych głowy (żyła twarzowa, nosowa, czołowa) oraz okołojajnikowego kompleksu naczyniowego świni
- receptora leptyny w splocie naczyniówkowym mózgu oraz w podwzgórzu świni
- receptora TLR4 (toll-like receptor) oraz CD14 w splocie naczyniówkowym komór mózgu owcy
4.6 Analiza gęstości optycznej wyrażonej w jednostkach densytometrycznych
- pomiary intensywności reakcji barwnej obserwowanej w mikroskopie z zastosowaniem programu Axio Vision Rel. 4.8.2
Wykaz aparatury
1. Urządzenia stosowane w doświadczeniach in vivo, ex vivo:
- Aparat do narkozy wziewnej dla dużych zwierząt (KOMESAROFF MINI-KOM)
- Kardiomonitor (TEMED)
- Pulsoksymetr z detektorem CO2 (Nonin Medical Inc. 9847V)
- Zestaw do badań na izolowanych narządach (UNIPER, UP-100; Hugo Sachs Elektronik-Harvard)
- Zestaw do badań na izolowanych naczyniach i mięśniówce gładkiej (HSE F30, type 372; Hugo Sachs Elektronik)
- Pompy infuzyjne
- Pompy perystaltyczne (Elphan, ZALIMP)
- Urządzenie do pomiaru przepływu krwi z transducerami (Narcomatic)
- Wiertarka chirurgiczna (Eskulap)
2. Sprzęt laboratoryjny stosowany w analizie western blot:
- Aparat do elektroforezy białek-pionowa (BIO-RAD PowerPac, Invitrogen)
- Aparat do mokrego transferu (BIO-RAD PowerPac)
- Mieszadło hematologiczne (Chemland)
3. Sprzęt laboratoryjny stosowany w analizie kwasów nukleinowych:
- Komora z przepływem laminarnym (Polon)
- Aparat do elektroforezy kwasów nukleinowych-horyzontalna (BIO-RAD PowerPac)
4. Sprzęt laboratoryjny stosowany w analizach RIA:
- Licznik do pomiaru promieniowania gamma (LKB)
- Licznik do pomiaru promieniowania beta (Beckman)
- Radiometr Rust-3 z sondą
5. Podstawowy sprzęt laboratoryjny:
- Aparat próżniowy BioVac 225 (OmegaLab)
- Spektrofotometr (Beckman)
- Mikroskop stereoskopowy
- Mikroskop MBL 180T
- Termoblok (OmegaLab)
- Worteksy (Biosan)
- Wytrząsarki (Biosan)
- Wytrząsarka z komorą inkubacyjną (Edmund Bűhler)
- Mieszadła magnetyczne (Biosan, IKA WERKE)
- Łaźnia wodna z przykrywką (Pracowania elektroniki i aparatury elektronicznej)
- pH-metr stacjonarny (HANNA instruments)
- Wirówki (Biosan, StarLab)
- Wirówka z chłodzeniem (Beckam,MPW Med. Instruments)
- Wagi elektroniczna (RADWAG, MEDICAT LTD)
- Ultrazamrażarka (SANYO)
- Wyciąg chemiczny (Polon)
- Wytwornica lodu (Scotsman)
- Aparat Hamilton Microlab 1000